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品牌 | 其他品牌 | 供貨周期 | 現貨 |
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應用領域 | 醫療衛生,化工,生物產業,農業,制藥 |
α酮戊二酸脫氫酶(αKGDH)測試盒
正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定
測定意義
α-KGDH(EC 1.2.4.2)廣泛存在于動物、植物微生物和培養細胞的線粒體中,是三羧酸循環調控關鍵酶之一,催化α-酮戊二酸氧化脫羧生成琥珀酰輔酶A。
測定原理
α-KGDH催化α-酮戊二酸、NAD+ 和輔酶A生成琥珀酰輔酶A、 二氧化碳和 NADH,NADH在340 nm有特征吸收峰,以NADH的生成速率表示α-KGDH活性。
需自備的儀器和用品
紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。
試劑的組成和配制
試劑一:100mL×1瓶,-20℃保存;
試劑二:20mL×1瓶,-20℃保存;
試劑三:1.5mL×1支,-20℃保存;
試劑四:液體20mL×1瓶,4℃保存;
試劑五:粉劑×1瓶,-20℃保存;
試劑六:粉劑×1支,-20℃保存;
樣本的前處理:
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離:
稱取約0.1g組織或收集500萬細胞,加入1mL試劑一和10uL 試劑三,用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
將勻漿600g,4℃離心5min。
棄沉淀,將上清液移至另一離心管中,11000g,4℃離心10min。
上清液即胞漿提取物,可用于測定從線粒體泄漏的α-KGDH(此步可選做)。
在步驟④的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三,超聲波破碎(冰浴,功率20%或200W,超聲3秒,間隔10秒,重復30次),用于線粒體α-KGDH活性測定。
測定步驟
分光光度計或酶標儀預熱30min以上,調節波長至340nm,蒸餾水調零。
樣本測定
(1)在試劑五中加入18mL試劑四充分溶解,置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴10min;現配現用;
(2)在試劑六中加入1mL蒸餾水,充分溶解待用;用不完的試劑分裝后-20℃保存,禁止反復凍融;
(3)在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑六和180μL試劑五,混勻,立即記錄340nm處20s時的吸光值A1和 2min20s后的吸光值A2,計算ΔA=A2-A1。
α-KGDH活性計算
(1) 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
α-KGDH活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr
(2) 按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
α-KGDH(nmol/min /g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=325×ΔA÷W
(3) 按細菌或細胞密度計算:
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活力單位。
α-KGDH活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=0.65×ΔA
V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cm;d:比色皿光徑,1cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應時間,2min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數,500萬。
b.用96孔板測定的計算公式如下
(1) 按樣本蛋白濃度計算:
單位的定義:每mg組織蛋白每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。
α-KGDH活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr
(2) 按樣本鮮重計算:
單位的定義:每g組織每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。
α-KGDH活性(nmol/min/g 鮮重)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W× V樣÷V樣總) ÷T=650×ΔA÷W
(3) 按細菌或細胞密度計算:
單位的定義:每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1 nmol的NADH定義為一個酶活性單位。
α-KGDH活性(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T=1.3×ΔA
V反總:反應體系總體積,2×10-4 L;ε:NADH摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cm;d:96孔板光徑,0.5cm;V樣:加入樣本體積,0.01 mL;V樣總:加入提取液體積,0.202 mL;T:反應時間,2min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;500:細菌或細胞總數,500萬。
上海牧榮生物科技有限公司
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